Summary
The most commonly used acetylcholinesterase (AChE) method for the diagnosis of Hirschsprung's
disease (HD) and intestinal neuronal dysplasia (IND) was first introduced in 1964
by Morris Karnovsky and Logan Roots. This technique requires about 80 - 120 minutes
incubation time and cannot be used for the intraoperative diagnosis of HD and IND.
To avoid these limitations, in 1994 Kobayashi et al first proposed an accelerated
modified method in two different versions, the first using diaminobenzydine (DAB)
reagent, the second using 4-chloro-1-naphthol as final reagent. In the present study,
we propose a new rapid variation of AChE staining which avoids the use of DAB and
naphthol, notably toxic reagents, but follows the same acceleration principle of Kobayashi's
technique. Our modified rapid AChE requires a total incubation time of only 8 minutes,
which is compatible with intraoperative histochemical examination purposes.
Intraoperative seromuscular or full-thickness intestinal biopsies were obtained from
92 children affected by intestinal dysganglionoses. The biopsies were frozen and cut
in 15 µm cryostatic sections. Rapid AChE was performed with a special incubation medium
using 3-amino-9 ethylcarbazole (AEC) as chromogenic substance. The two complementary
histochemical techniques alpha-naphthylesterase (ANE) and lactate-dehydrogenase (LDH)
were also used intraoperatively for the staining of ganglion cells. The diagnosis
was confirmed postoperatively with conventional AChE Karnovsky technique, comparing
the extensions of hyperganglionic, hypoganglionic and aganglionic segments in each
studied case.
The new rapid AChE modified method can identify ganglion cells and fibers using a
dark brown precipitate. In all the cases studied, the intestinal innervation pattern
identified with this modified technique was similar to that obtained with Karnovsky
AchE. Seventy-eight HD, 8 isolated IND and 6 HD associated with an evident IND segment
were diagnosed.
This new rapid AChE histochemical technique avoids the use of DAB and naphthol, and
can thus be considered safe for operators. Rapid AChE is a valid tool for both the
evaluation of aganglionosis extension and for the identification of IND pattern during
surgery. We recommend this very reliable method for the intraoperative diagnosis of
HD and IND, in association with other enzymatic markers of ganglion cells (ANE or
LDH). We propose the following diagnostic protocols: a) for preoperative histochemical
study: conventional AChE plus LDH and NADPH-diaphorase; b) for intraoperative study:
rapid AChE plus ANE.
Résumé
Très fréquemment, la méthode par l'acétylcholinesterase (AchE) est utilisée pour le
diagnostic de la maladie de Hirschsprung (HD) et les dysplasies intestinales neuronales
(IND). Cette technique a d'abord été introduite en 1964 par Morris Karnovsky et Logan
Roots. Cette technique nécessite environ 80 à 100 minutes d'incubation et ne peut
pas être utilisée pour le diagnostic per-opératoire de HD et de IND. Pour éviter ces
limitations, en 1994 Kobayashi et collaborateurs proposèrent d'abord une méthode accélérée
modifiée dans deux différentes versions, la première utilisant la diaminobenzydine
(DAB), la seconde utilisant le 4-chloro-1-naphtol comme réactif. Dans la présente
étude, nous proposons une nouvelle variation de la coloration par l'acétylcholinesterase
qui évite l'utilisation de DAB et de naphtol, mais qui entraîne la même accélération
que la technique de Kobayashi. Notre méthode modifiée AchE nécessite une incubation
totale de 8 minutes seulement, qui est compatible avec son utilisation en per-opératoire.
Des biopsies per-opératoires séro-musculaires ou épaisses de l'intestin étaient obtenues
chez 92 enfants atteints de dysganglionoses intestinales. Les biopsies étaient congelées
et coupées en sections de 15 µm. La technique rapide AchE était réalisée avec une
incubation utilisant le 3-amino-9 éthylcarbazole (AEC) comme substance chromogène.
Deux techniques histochimiques complémentaires alpha-naphthylesterase (ANE) et lactate-dehydrogénase
(LDH) étaient aussi utilisées en per-opératoire pour la coloration des cellules ganglionnaires.
Le diagnostic était confirmé en post-opératoire avec une AchE conventionnelle. Nous
comparons l'extension des segments hyperganglionnaires, hypoganglionnaires, et aganglionnaires
dans chaque cas étudié.
La nouvelle méthode AchE rapide modifiée peut identifier des cellules ganglionnaires
et des fibres en utilisant un précipité brun foncé. Dans tous les cas étudiés, l'aspect
de l'innervation intestinale identifiée avec cette technique modifiée était similaire
à celle obtenue avec la technique Karnovsky AchE. Soixante dix-huit HD, 8 IND isolées
et 6 HD associées avec un segment de IND étaient diagnostiquées. Cette nouvelle technique
histochimique rapide AchE évite l'utilisation de DAB et de naphtol et peut alors être
considérée comme sûre pour les techniciens.
La méthode rapide AchE est un outil efficace pour à la fois l'évaluation de l'extension
aganglionnaire et pour l'identification des IND durant l'acte chirurgical. Nous recommandons
cette méthode très sûre pour le diagnostique intra-opératoire de HD et de IND en association
avec d'autres marqueurs enzymatiques des cellules ganglionnaires (ANE ou LDH). Nous
proposons le protocole diagnostique suivant: a) pour une étude histochimique pré-opératoire:
AchE conventionnelle plus LDH et NADPH-diaphorase; b) pour l'étude intra-opératoire:
ACHe rapide plus ANE.
Resumen
El método más ampliamente usado para el diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung
(HD) y de la displasia neuronal intestinal (IND) es el de la acetilcolinesterasa (ACHe)
introducido inicialmente en 1964 por Karnovsky y Roots. Esta técnica requiere unos
80 a 120 minutos de incubación y no puede, por lo tanto, ser usada para el diagnóstico
intraoperatorio de HD e IND. Para evitar estas limitaciones Kobayashi y colaboradores,
propusieron en 1994 un método acelerado modificado en dos versiones diferentes: la
primera usaba diaminobencidina (DAB) y la segunda 4-cloro-1-naftol como reactivos.
En el presente estudio proponemos una nueva variación rápida de la tinción ACHe que
evita el uso de DAB y naftol que son notablemente tóxicos pero que sigue el mismo
principio de aceleración que la técnica de Kobayashi. Nuestra técnica rápida modificada
ACHe requiere un tiempo total de incubación de sólo 8 minutos que es compatible con
el examen histoquímico intraoperatorio.
Obtuvimos biopsias intraoperatorias seromusculares o de pared total de 92 niños con
disganglionosis intestinal. Las biopsias se congelaron y se cortaron a 15 µm. Se realizó
la prueba rápida de ACHE con un medio de incubación especial usando 3-amino-9-etilcarbazol
(AEC) como sustancia cromogénica. También usamos las dos técnicas histoquímicas complementarias
alfa-naftil-esterasa (ANE) y lactato-deshidrogenasa (LDH) intraoperatoriamente para
teñir las células ganglionares. El diagnóstico se confirmó postoperatoriamente con
técnica convencional de ACHe de Karnovsky comparando las extensiones de los segmentos
hipergangliónico, hipogangliónico y agangliónico en cada caso.
La nueva técnica rápida de ACHe puede identificar las células ganglionares y las fibras
mediante un precipitado pardo oscuro. En todos los casos estudiados la inervación
intestinal se identificó con esta técnica modificada de forma similar a como se hace
con la técnica convencional de Karnovsky. Fueron así diagnosticadas 78 HD, 8 IND aisladas
y 6 HD asociadas con IND.
Esta nueva técnica histoquímica rápida de ACHe evita el uso de DAB y naftol y puede
ser considerada como más segura para los técnicos.
Zusammenfassung
Die weit verbreitete Acetylcholinesterase-Färbung in der Diagnose des Morbus Hirschsprung
und der intestinalen neuronalen Dysplasie wurde zuerst 1964 von Morris Karnovsky und
Logan Roots beschrieben. Diese Technik benötigt eine Inkubationszeit von ca. 80 -
120 Minuten und kann deshalb für die intraoperative Diagnostik eines Morbus Hirschsprung
oder einer IND nicht angewendet werden. Um diese zeitliche Limitierung zu vermeiden,
schlug Kobayashi als erster 1994 einen Schnelltest vor. Dabei propagierte er zwei
Versionen: Eine Technik, die Diaminobenzydine (DAB) verwendet, eine zweite, bei der
4-Chloro-1-Naphthol als abschließendes Reagenz verwandt wird. In der vorliegenden
Studie wird ein neuer Acetylcholinesterase-Schnelltest vorgeschlagen, bei dem sowohl
DAB wie Naphthol wegen ihrer hohen Toxizität vermieden werden. Dennoch folgt der Test
den Prinzipien der Technik von Kobayashi. Die modifizierte Technik der Acetylcholinesterase-Färbung
erfordert eine Gesamtinkubationszeit von nur 8 Minuten, was eine Verwendung des Tests
im Rahmen einer Schnellschnittuntersuchung erlaubt.
Von 92 Kindern mit IND wurden intraoperativ serummuskuläre Ganzwandbiopsien entnommen.
Die Biopsien wurden gefroren und im Kryostaten in 15 µm-Schnitten aufgeteilt. Der
Acetylcholinesterase-Schnelltest wurde innerhalb der verkürzten Inkubationszeit in
einem Medium aus 3-Amino-9 Ethylcarbazole (AEC) als chromogene Substanz durchgeführt.
Um die Ganglienzellen zu färben, wurden die histochemischen Techniken der Alphanaphthylesterase-
(ANE) und Lactatdehydrogenase-Färbung komplementär durchgeführt. Postoperativ wurde
die Diagnose mit der konventionellen Acetylcholinesterase-Färbetechnik nach Karnovsky
überprüft und insbesondere die Ausdehnung von hyperganglionären, hypoganglionären
und aganglionären Segmenten in jedem individuellen Fall mit der Schnellschnittuntersuchung
verglichen.
Der neue Acetylcholinesterase-Schnelltest erlaubt eine Identifizierung der Ganglienzellen
und der parasympathischen Nervenfasern, die sich als dunkle braune Präzipitate darstellen.
In allen untersuchten Fällen entsprach das mit dem Schnelltest untersuchte Innervationsmuster
dem der späteren Karnovsky-Färbung. 78 Patienten mit Morbus Hirschsprung, 8 mit isolierter
IND und 6 mit einer Kombination von Morbus Hirschsprung und IND wurden diagnostiziert.
Schlussfolgerung: Der neue Acetylcholinesterase-Schnelltest erlaubt die Vermeidung des toxischen Diaminobenzydins
oder Naphthols und ist daher sicher für den Operateur und den Pathologen. Die Acetylcholinesterase-Schnellfärbung
erlaubt sowohl das Ausmaß der Aganglionose wie die Identifizierung dysganglionärer
Veränderungen während des Eingriffes. Der Schnelltest wird daher als verlässliche
Methode zur Diagnose des Morbus Hirschsprung und der neuronalen intestinalen Dysplasie
empfohlen, wobei jedoch postoperativ auch andere enzymatische Marker wie ANE oder
LDH verwandt werden sollten. Im Einzelnen wird empfohlen, präoperativ eine histochemische
Untersuchung mit konventioneller Acetylcholinesterase-Färbung, LDH-Färbung und NADPH-Diaphorasefärbung
durchzuführen und intraoperativ einen Acetylcholinesterase-Schnelltest plus ANE vorzunehmen.
Key words
Hirschsprung's disease - Intestinal neuronal dysplasia - Acetylcholinesterase - Histochemistry
- Enteric nervous system
Mots-clés
Maladie de Hirschsprung - Dysplasie neuronale intestinale - Acetylcholinesterase -
Histochimie - Système neuro-entérique
Palabras clave
Enfermedad de Hirschsprung - Diplasia neuronal intestinal - Acetilcolinesterasa -
Histología
Schlüsselwörter
Hirschsprung-Krankheit - IND - Acetylcholinesterase - Histochemie - enterales Nervensystem
